CKD・透析と低亜鉛血症

本日は、血管石灰化におけるカルシプロテイン粒子とマグネシウム、亜鉛の役割についてお話します。

私たちが力を入れて研究している物質に「カルシプロテイン粒子」というものがあります。通常、細胞培養に用いるカルシウムを含む培地に血清と無機リンを加え、しばらく放置しているとこのようなナノ粒子が自然とできてきます。

これが「カルシプロテイン粒子:CPP」です。成分はリン酸カルシウムを吸着した血清蛋白「Fetuin-A」の凝集体であります。

CPPの形成過程では、水溶液中でカルシウムと無機リンの濃度が飽和状態になりますと「リン酸カルシウム」が析出して参ります。
まず最初に形成されるリン酸カルシウムは、粒子径約0.9nmのPosner clusterと呼ばれる小さな粒子です。Posner clusterが凝集して「Amorphous（非晶質）のリン酸カルシウム」に成長して行きますが、Fetuin-Aの存在下では、リン酸カルシウムはFetuin-Aに速やかに吸着されるため、リン酸カルシウム粒子の成長を防いでいてくれています。
Fetuin-Aは、リン酸カルシウムを吸着する能力に優れたタンパクで、Fetuin-A１分子あたりposner clusterを120個吸着できると言われています。リン酸カルシウムを吸着したFetuin-Aの事を出来立てのCPPという意味で私共は「naïve CPP」と呼んでいます。
その後時間の経過ととも、非晶質のリン酸カルシウムが結晶構造をもつリン酸カルシウムへと相転移（phase transition)を起こしたり、naïve CPPが相互に凝集したりして、粒子径の大きな（35nm以上）mature CPPへと自発的に変化していきます。

CPPは単なる細胞培養の実験中に形成される人工産物ではなく、実際にヒトの血中を流れている物質であることが報告されています。
大阪大学 腎臓内科の濱野先生らの報告によれば、CKDの進行とともに、Reduction rateで計測できる血中CPPレベルがする上昇する事を確認しています。Reduction ratio(RR)=｛(serum Fatuin-A)-(supernatant fetuin-A)｝/　(serum Fatuin-A)　×100（％）

また、別のグループからは、腎機能が低下すると血中CPP（カルシプロテイン粒子：Ca sedimented）が増えることが報告されています。

さらに血中CPP値は、CACS:冠動脈石灰化スコアと相関することや、慢性炎症や動脈の硬さの臨床指標とも相関することが報告されています。
血中CPPの上昇を種々の変数にて三分位で検討したところ、炎症の程度を表す「高感度CRP」と動脈の硬さを測る「脈波伝達速度」の相関が有意に認められました。

実際、mature CPPを培養血管平滑筋細胞に添加すると、石灰化が誘導されます。
アリザリンレッドというリン酸カルシウムを赤く染める染色で石灰化を評価すると、赤く染まっています。したがって、腎機能が低下すると血中CPP（カルシウム沈降物：Ca sedimented）が増加することから、CPPが血管石灰化の原因物質である可能性が考えられます。

血管平滑筋細胞の石灰化を抑制する物質として、亜鉛が注目されています。

培養平滑筋にリンの供給源となるbeta-glycerophosphateを加えて培地中でCPPの形成を促し、11日間培養した後、アリザリンレッドというリン酸カルシウムを赤く染める染色で石灰化を評価すると、亜鉛の添加によって石灰化が軽くなる事が分かります。

さらに、血管石灰化のモデルであるKlothoマウスを、亜鉛を含む飲み水で飼育すると、血管石灰化が軽減することも報告されました。

亜鉛が血管石灰化を抑制するメカニズムとして、血管平滑筋細胞の骨芽細胞様形質変換を抑制する可能性が指摘されています。

血管平滑筋細胞を石灰化誘導培地で培養すると、細胞質でNFkBがリン酸化を受けて核内へ移行し、骨芽細胞への形質変換を促す転写因子として機能します。
その結果、平滑筋細胞が骨基質蛋白を分泌するようになり、そこにリン酸カルシウムが沈着して石灰化をきたすようになります。しかし、培地に亜鉛を添加しておくと、NFκBの核内移行が抑制されることが分かります。この時、TNFalpha-induced protein-3の発現が誘導され、これがNFκBのリン酸化を抑制する作用があることが知られています。

まとめますと、メカニズムの詳細は未だ解明されていませんが、血管平滑筋細胞の培地中のCPPが増加すると、NFκBがリン酸化を受ける可能性があります。
NFκBのリン酸化は骨芽細胞様形質変換を誘導し、骨基質蛋白が分泌され、そこにリン酸化カルシウムが沈着して石灰化が進むと考えられています。
しかし、亜鉛の存在下では、亜鉛がZinc sensing receptorである「GPR39」に作用し、何等かのメカニズムを介してTNFAIP3の発現を誘導します。
これがNFκBシグナルを抑制することで、血管平滑筋の石灰化を抑制する可能性が考えられます。

亜鉛が血管石灰化を抑制するメカニズムとして、もう一つの可能性として考えられるのが、CPPに対する直接作用です。

最近、mature CPPの「できにくさ」を定量する臨床試験結果が報告されました。
血漿サンプルに無機リンとカルシウムを添加してCPPの形成を促進させた条件下で、サンプルの濁度を経時的に測定する、という試験です。
最初のうちは濁度は変わらないのですが、数時間後に突如、濁度が上昇し、その後再び定常状態になるという現象が観察されます。この濁度の急上昇は、CPPが突如凝集して巨大化したことによるもので、同時に非晶質から結晶へ相転換が起こる事もわかってきました。
このように濁度が急上昇するまでの時間を「T50」と定義します。
T50が短いほど「mature CPPができやすい血液である」と考えられます。実際、慢性腎臓病患者では、T50が短い患者ほど動脈硬化が高度で、生命予後が悪いことが報告されています。
この測定系に何を加えたらmatureCPPの形成が抑制されるか検討されております。

たとえば、Fatuin-A、アルブミン、マグネシウムを添加するとT50が延長します。逆に、リゾチーム、カルシウム、リン酸はT50を短くする方向に働きます。
では亜鉛はどうかということですが、亜鉛を加えてもT50に変化がなかった、という実験結果が報告されています。

ただ、亜鉛がCPPに何の影響も与えないか、というと必ずしもそうではない可能性があります。
バイオマテリアルの分野では、骨折した部位などにリン酸カルシウムを含むハイドロゲルを塗布することで骨再生を促す研究が行われています。この際、結晶のリン酸カルシウムよりも非晶質のリン酸カルシウムの方が、生体に利用されやすいので、いかにしてハイドロゲルの中のリン酸カルシウムを非晶質の状態に長期間保つかがポイントとなります。
最近の研究で、ハイドロゲルにクエン酸や亜鉛を加えると、相転換が抑制されて非晶質の状態が保てるとの報告がありました。
亜鉛がないと、数時間内にアモルファスから結晶に変わりますが、亜鉛を加えておくと数週間もアモルファスの姿を保つということが分かってきました。

まとめますと、まず亜鉛には血管平滑筋細胞の骨芽細胞様形質変換を抑制する作用があると考えられます。
さらに、リン酸カルシウムの相転換を抑制してmature CPPの形成を抑制する作用もあると考えられます。これらの作用により、亜鉛で血管石灰化を予防できる可能性が示唆されました。

当院で得られた自験例について、紹介させていただきます。
なお、本日ご紹介するデータについて一部原著に記載されていないものがございますがご了承ください。

ノベルジン錠は、ウイルソン病治療剤の銅吸収阻害剤として発売されていましたが、2017年、その効能・効果に「低亜鉛血症」が追加になりました。
現在のところ、国内で低亜鉛血症の適応を持つ薬剤はノベルジン錠のみであります。

ノベルジン錠の添付文書には「本剤投与開始時及び用量変更時には、血清亜鉛濃度の確認を行うこと」と記載されています。

また、ノベルジン錠はもともとウイルソン病の治療薬として開発されており、血清銅を低下させる薬理作用があります。
そのため、漫然と投与し続けた場合、血清銅が低下する場合がありますので「血清銅濃度を定期的に確認することが望ましい」とも注意喚起がなされています。

重大な副作用欄には、「栄養状態不良の患者で銅欠乏をおこすおそれがある」と記載されています。

ここで、体内における亜鉛と銅と鉄のバランスについて考えてみましょう。亜鉛と鉄は吸収時に競合的拮抗作用が働きます。

消化管粘膜の非ヘム鉄輸送体DMT1は、鉄の他に、亜鉛や銅のような、2価の陽イオンも輸送しますので、これらの消化管吸収の共通の経路となっています。

しかし、銅には、2価の銅イオンとして、DMT1で鉄や亜鉛と競合する経路だけでなく、十二指腸において、2価から1価に還元されて吸収される経路があります。また、亜鉛の主なトランスポーターは、ZIP4とZnT1であります。

鉄や銅の場合、DMT1を通過する前に酸化型から還元型に変化する必要がありますが、ZIP4での亜鉛の吸収過程では、酸化還元の反応過程は必要としていません。

このように、亜鉛と鉄はDMT1経路での吸収において競合的拮抗作用が働きます。
一方、亜鉛と銅の関係では、亜鉛のメタロチオネイン誘導により銅の吸収が阻害されます。

メタロ(=金属)チオ(=SH基）ネイン(protein)、このメタロチオネインに亜鉛は7個、銅は12個結合します。
メタロチオネインは通常の状態では亜鉛と結合していますが、カドミウム、水銀、銅などのほうが亜鉛より結合力が強いため、これらの濃度が相対的に高い状態では亜鉛と置き換わります。
銅はメタロチオネインと結合すると、吸収されずに糞便中に排泄されます。

従って、亜鉛の濃度が高くなると、鉄や銅は吸収されにくくなります。

このように、亜鉛含有製剤を投与することにより血清銅濃度が低下する可能性があるため、亜鉛欠乏の透析患者に対する亜鉛補充療法中の血清亜鉛濃度と血清銅濃度の変化を調べて、低銅血症が生じない適切な亜鉛補充方法を探ることを目的に研究を行いました。

血清亜鉛値には日内変動があり、午前に値が高く午後に約20%低下する傾向を示すことが知られているため、午前透析の通院維持透析患者36名を対象として後方視的観察を行いました。
男性17名、女性19名、平均年齢69.6歳、平均透析歴8.5年、透析導入原疾患はスライドに示す通りです。

亜鉛欠乏症（60μｇ/dL未満）及び潜在性亜鉛欠乏（60～80μｇ/dL未満）の患者に対し、ポラプレジンク150㎎（亜鉛として34㎎）/dayの継続投与か酢酸亜鉛水和物167.84㎎（亜鉛として50㎎）/dayの新規投与で亜鉛補充を行う後ろ向き研究で、3か月毎に血清亜鉛濃度と血清銅濃度を比較しました。
なお、血清銅濃度測定は、血清亜鉛濃度測定を始めた8か月後から測定を開始しました。当院の血清銅濃度の基準値は、78～131μｇ/dLです。

本研究では、亜鉛80㎍/dL未満を亜鉛欠乏、銅78㎍/dL未満を銅欠乏とし、亜鉛補給後の亜鉛と銅の変化を検討しました。

症例構成は、酢酸亜鉛水和物投与群16例、ポラプレジンク投与群12例、血清銅濃度が基準値以下となった酢酸亜鉛水和物投与中止群8例の、計36例について8か月目と11か月目の血清亜鉛濃度及び血清銅濃度の推移を検討いたしました。

投与後8か月目と11か月目の血清亜鉛濃度値と血清銅濃度値の状況をお示し致します。
まず、○印は酢酸亜鉛水和物亜鉛として50mg/dayを8か月継続投与した16例における血清亜鉛濃度値と血清銅濃度値です。ほとんど、銅欠乏を認めていません。
次に●印は、11か月酢酸亜鉛水和物を投与した後の亜鉛と銅の関係で、○からの⇒でそれぞれ銅低下傾向を示していることが見られました。
また、赤色の点線で示す近似曲線は、銅の正常値の下限78㎍/dLと、ちょうど血清亜鉛濃度値120㎍/dL付近で交差しています。
血清亜鉛濃度値が120以上になると、ほとんどの症例で血清銅濃度値は基準値以下になっています。
これより今一度推移について分かりやすくご紹介致します。

亜鉛と銅を同時に測定し始めたときの、亜鉛と銅の関係です。
酢酸亜鉛水和物を8か月投与継続したなかで8例（35%)が銅欠乏でしたので、この後本剤の投与を中止しています。

その後も、酢酸亜鉛水和物の投与を継続した症例では、その3か月後、オレンジ色のように変化しました。
酢酸亜鉛水和物50mg投与を11か月継続すると、さらに7例（44%）が銅欠乏になりました。

次に、このように亜鉛補充を数か月継続していて低銅血症になる場合、3か月前の血清亜鉛濃度が、それぞれ、どの程度まで上昇していたかを調査しました。
黄色で示すのは、低銅血症になった症例の3か月前の亜鉛値です。低銅血症になる3か月前の亜鉛濃度が100µg /dL以下の症例も3例ありましたが、亜鉛が100µg/dL以上になっていたら、3か月後に80%が低銅血症になっています。
亜鉛補充を数か月継続していて、亜鉛値が100㎍/dL以上になっていたら、3か月後に低銅血症になる確率が高いことが分かります。

8か月以上亜鉛を投与した後の亜鉛と銅の関係です。
散布図全体の赤色の点線で示す近似曲線は、血清銅濃度値の正常値の下限78㎍/dLとちょうど血清亜鉛濃度値120㎍/dL付近で交差しています。
血清亜鉛濃度値が120以上になると、血清銅濃度値は基準値以下になると思われます。
本研究では、血清亜鉛濃度値80㎍/dL未満を亜鉛欠乏、血清銅濃度値78㎍/dL未満を銅欠乏とし、亜鉛補充後の血清亜鉛濃度と血清銅濃度の変化を検討いたしましたが、

血清銅濃度の基準を他の検査会社の基準値を用いて68㎍/dL未満を銅欠乏としますと、赤色の点線で示す近似曲線は、血清銅濃度の正常値の下限68㎍/dLとちょうど血清亜鉛濃度値130㎍/dL付近で交差しています。
血清銅濃度の基準値を低くしても、血清亜鉛濃度が130μｇ/dL以上になると、血清銅濃度は基準値以下になると思われます。

次に、血清銅濃度値が基準値以下になったために酢酸亜鉛投与を中止した8例の血清亜鉛濃度値と血清銅濃度値の散布図の3か月後の変化を示します。
これより推移についてわかりやすくご紹介します。

酢酸亜鉛水和物投与中止時の、血清亜鉛濃度値と血清銅濃度値を示しています。
酢酸亜鉛水和物の投与を中止して3か月後、血清亜鉛濃度値は低下しましたが、血清銅濃度値は77%が正常範囲内に戻りました。
特に、ココアを飲むなどの栄養指導は行わずに酢酸亜鉛水和物の休薬のみで、血清銅濃度値は上昇しました。

日本臨床栄養学会の「亜鉛欠乏症の診療指針2018」では「亜鉛投与中は、定期的（数か月に1回程度）に血清亜鉛、銅、鉄を測定する。血清亜鉛値が250㎍/dL以上になれば、減量する」と記載されています。
しかし、透析患者の場合には、今回の亜鉛と銅の血清濃度測定結果からは、血清亜鉛濃度が120㎍/dL、もしくは130㎍/dL以上になれば、減量することが望ましいと考えられました。
指針に数か月に1回程度と記載がありますので、3か月ごとに検査を行っております。

結論です。
透析患者の亜鉛欠乏症では、血清亜鉛濃度と、血清銅濃度を定期的に確認しながら、亜鉛補充を行う必要があります。
亜鉛補充は保険適用のある酢酸亜鉛水和物を亜鉛として1日50mgで開始し、目標の血清亜鉛濃度は、80～120µg/dLが望ましいといえます。
血清亜鉛濃度が100µg/dL以上になれば、 酢酸亜鉛水和物を亜鉛として25mgに減量することも、選択肢の一つといえるでしょう。
特に栄養不良の患者には注意が必要です。
本研究の結果より、血清亜鉛濃度が120µg/dL以上になれば減量または休薬を推奨いたします。